本方案适用于二代、三代平台得到的测序数据分析；

目前主流三代测序技术平台：
pacbio测序
牛津纳米孔测序
GeneCare测序

二代主流测序技术：
Illumina solexa合成测序；
Roche454焦磷酸测序平台
ABI SOLiD连续发测序；
BGI纳米球测序（即华大基因公司测序技术平台）

自从三代测序广泛应用于市场，作为新生代生物学大行业的一员，不懂一点点生物信息学如何能在圈内混下去？？

测序公司提供的结果很多，我们最关心的可能包括：

1）微生物群落种类及其比例（可能需要二次计算）信息；

2）样品中测序得到的所有可及的基因序列信息（提供的往往是序列组 XXXX.fa格式）及其功能注释表

        这其中，每个样本得到的序列数量，少则几万条，多则上百万条；几十万条是很常见的；注释表一般是XXXX.xls格式；

3）与“2）”对应的氨基酸序列（即多肽、蛋白序列），编号与核酸序列的对应关系（因为去重等分析，不一定是连续编号；有时候也可能不能相互对应）；

那么，我们如何区挖掘对我们来说有用的序列，也就是我们的 靶标序列？？

这也许是困扰很多人的共性问题。

我在这提供一个基于个人经验的方案仅供参考：

第一种方案，基于原始功能注释的特定功能基因挖掘：

        特点：所有人通用，皆可使用；缺点：没有细分，对酶功能的注释可能不太准确，（不要求也便无所谓）；

1）基于CARD、CAZy、eggNOG、KEGG分析得到一个数据列范围，比如甘露聚糖酶【本人近期在挖掘的一个基因，当前是在功能分析阶段】

        那么这些注释是否准确可信？是否唯一（是否具有创新性？）？在序列上发表的特定功能基因有多大差别？

        这些问题将决定着我们选择的基因或蛋白序列，是否能够具有相应的功能，是否可以具有创新性而不是简单重复他人的步子；

2）怎么做？怎么分析，怎么筛选怎么排除？

工具准备：

1）最好是有一个高配电脑、服务器级别的更好，能够借用企业、省市级的计算中心进行运算更好；

2）软件平台：Excel（或WPS）基本的吧，Emeditor基本的吧；

        为了方便数据的处理，一个纯Linux系统或Linux子系统（如WSL），这算是基本的吧；
WSL，即 windows subsystem Linux；安装方法不做介绍，大家万仙过海，各显神通吧；

3）如果仅仅使用Excel也能做一点工作，前提是你可以打开CARD、CAZy、eggNOG、KEGG结果中准备的大型.xls格式文件（完整打开，不是截取，也不是部分打开哈）；完了做筛选（功能基因初筛）；不同注释的结果文件之间可以进行数据匹配——可借助excel中的vlookup函数【这个就有点小小高级了哈】，小数据量时很好用（当数据量巨大时，可能载入和计算会成为问题）；

        这时候，emeditor就能大显神威了，可方便地进行千万条序列级别、数据之间的筛选操作（能不能相互匹配这个，我还没研究出来）；用它筛选出来了特定功能的序列编号之后，就可以进行不同注释结果之间的比较了。

        这样，就能够得到一个共同的交集；也即，符合你的特定需求的一个子序列库；

        这一波操作下来，拿着这样一个小型的序列库，进行下游分析，就方便多了；

4）序列提取

        对于XXX.fa文件，动则几百MB大小，Excel提取是有些吃不消的；

        借助emeditor等专业软件是可以的，只是单纯的emeditor提取，可能会比较费事；这种情况下，可能就需要结合一些编程工具，或是正则表达式，python，java之类；大家各显神通吧；

        个人提取过程，是结合了CLC genomics trial version 【至于如何trial and trial again，这里默认大家都懂的哈】和一个键盘记录程序（由于CLC本身并不支持特定序列表文件、或是具备特定功能的序列提取功能），以便批量从宏基因组测序//三代测序的巨大序列文件中，提取得到特定编号、或是具备特定功能、特定结构域的序列；

        比如你要从100万条的序列文件中提取其中符合你要求的20 000条序列，用大概2018年左右的高配电脑，在下班前设置好，大概到第二天早上上班时，就能够得到需要的结果；导出，保存即可。

        万物皆可淘宝/咸鱼，能人异士很多，在万千的ID中，去伪存真，找到那个阑珊处的the right one，还是要好好发掘，能够节省很多时间；

////||||\\\\某鱼         “ Interpro Pfam蛋白功能重批注、注释 ”
////||||\\\\某鱼        “ 蛋白表达亚细胞定位分析；全流程 ”
////||||\\\\某鱼         “病毒蛋白亚细胞定位 ”
////||||\\\\某鱼         “Enzyme function prediciton using constrative learning 可开发P ”
||||\\\\某鱼         “signalp6 分泌信号肽预测 可开发P ”
////||||\\\\某鱼         “全基因组间序列比对，找差异表达序列 ”
////||||\\\\某鱼         “ 序列进化树作图，系统进化树作图； ”
////||||\\\\某鱼          “ pacbio测序数据分析，功能酶挖掘，可开发P ”
////||||\\\\某鱼        CataPro蛋白酶活性预测 可批量；
////||||\\\\ ProtComp 细菌、真菌蛋白亚细胞定位分析
        --- 可批量操作基因组级，细菌基因组大约含有3000条序列，真菌大约4000多条，部分含有质粒的可能更多；
        ---- 对于数量大于1 0000 条序列的分析，需单独协商，毕竟，这并不仅仅是数量的增加，分析过程；处理数据的过程；难度增加，并不是线性关系；

————————————————

                            

第二种方案，基于蛋白序列的功能基因挖掘（核酸——蛋白，对应着，用哪个都行对吧?)

        这个需要一定的技术基础；

大致就是，对于第一方案得到的初筛结果，或者是妥妥的纯原始蛋白序列，挑选处对应的蛋白序列，挑选思路更上面是一样的。

        得到序列之后，批量进行Interpro Pfam蛋白功能重批注、signalP6信号肽预测、blastp、CLEAN蛋白酶功能分析等等；

        这一波操作下来，对于大部分人来说，你需要的target序列，已经是呼之欲出了；至少是有了一个小范围的序列子库；接下来，是进行序列库再分析，还是二次、三次筛选，还是直接实验验证，就都是小case了；

简单解释一下：

1）Interpro Pfam蛋白功能批注，应是根据蛋白序列的功能域相似性做的工具；有在线版，大家可以尝试（但往往在线版会有一些限制，比如提交的序列数不能超过多少条，比如分析时间过了多少分钟会 超时失败之类）请大家根据需求自行尝试；

https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/releases/
https://github.com/aziele/pfam_scan

        Pfam domain search，需要Linux环境，WSL就可以，各位可以在windows系统下进行安装，过程国内网站很多了；

        这个是pfam库，当前2025.01.再次测试时，发现v37版本的Pfam批注库已经上线，同时相关接口API的软件也可线下下载使用；批注结果与线上批注结果一致；

2) 分泌信号肽预测

        分泌信号肽预测工具，网上资源很多了；个人是比较熟悉和推荐DTU health tech提供的信号肽分析服务（因为他们总是在更新嘛，目前是到了signalP6），应当是当前学界最新最准确的版本了吧？？

https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/

        怎么得到预测结果，我相信大家都可以无师自通哈；

        全基因组级的预测分析也可以找我的哈000000

3）blastp，即对应NCBI网站上面的 protein-protein blast，原理推测应该是结合蛋白序列相似性

        对于几千条、几万条序列，还是可以轻松拿捏的；

        我总觉得，除了关键结构域序列比对、motif特征匹配之外，这个蛋白序列的直接比对，是预测自己手里蛋白序列可能存在功能最靠靠的手段之一……；

4）CLEAN酶功能注释——这个是2023年science发表文章发布的工具，也是自评为当前最准确的工具；其对蛋白酶功能预测的准确度达到80%~100%，这不就完美了嘛？

https://github.com/tttianhao/CLEAN

        提示一点哈，这个工具比较占用硬盘空间，也需要高配电脑的支持，比如原作者提到平台运行内存需要>12 G；而个人安装后wsl占用空间足足增加了12G-13G，这个对于现在的大家来说，应该都不是太大问题；随便一台4K以上的笔记本，基本上都可以满足这样的需求；当然如果你要分析巨量数据的话，个人建议最好还是在台式机上面跑；毕竟台式机较之笔记本，还是会皮实很多，至少在散热方面，台式机有其天然优势；

        对于2万以内的序列数，个人的经验和建议是，为了挖掘特定的酶功能序列（编号），这些工具都走一遍，这样就可以对序列注释有一个清醒的认识；基本能够确定那些功能有挖掘必要，那些没有；那些序列他人已经发觉过了，那些还没有；那些序列编码的产物大概率可溶，那些基本没有机会；

        上述经验对于酶基因的挖掘尤其适用；

        比如您想要挖掘小分子，如抗菌肽/细菌素；更小分子如胰岛素基因、抗生素编码相关基因，上面这些可能还仅仅只是基础、却远远不够；

        不过，还是有不少可以替代的工具，比如：
DNAMAN (V9.0)、
MAFFT (https://github.com/Schaudge/MAFFT)
MUMmer（https://github.com/mummer4/mummer）
        等多种软件，就提供了多种可能性；这就方便了大家很多了；

        比如知道一个一致靶标序列，长度为25-30的话，通过挑选特定长度的序列，如氨基酸序列长度25-30的，与你自己的靶标序列进行比对，就能够挖掘出来序列相似度很高的 “潜在基因、潜在蛋白”序列；

        以上，先这么多吧；毕竟是免费分享，大家时间都是有限不是？

        以后心情好了，时间宽裕了再来分享 以挖掘部分功能基因，表达产物功能验证的情况。

        大家有特殊需求的，也可私信联系交流。